試劑和材料準備

• FITC：選擇品質(zhì)良好、純度較高的異硫氰酸熒光素，一般可使用無水二甲基亞砜（DMSO）將其溶解配制成 1mg/ml 的溶液，且需現(xiàn)用現(xiàn)配，因為 FITC 在儲存過程中可能會分解失效.

• 乳糖：將乳糖溶解在適當?shù)木彌_液中，如 0.1M、pH 9.0 的碳酸鈉緩沖液，配制成一定濃度的溶液，濃度可根據(jù)具體實驗需求進行調(diào)整，但一般不宜過低，以保證有足夠的乳糖參與反應.

標記反應

• 混合溶液：在避光條件下，將 FITC 溶液緩慢地逐滴加入到乳糖溶液中，邊加邊輕輕攪拌，使二者充分混合均勻 。一般每毫升乳糖溶液中可加入 50μl 的 FITC 溶液，但具體用量也可根據(jù)實驗優(yōu)化的結(jié)果進行調(diào)整.

• 反應條件：將混合后的溶液置于 4℃的黑暗環(huán)境中孵育反應，反應時間通常為 8 小時左右，但為了確定最佳反應時間，可設(shè)置不同的時間梯度進行預實驗，如 4 小時、6 小時、8 小時、10 小時等，以找到標記效率較高的反應時間.

反應終止與純化

• 終止反應：向反應體系中加入適量的氯化銨，使其終濃度達到 50mM，以終止 FITC 與乳糖的反應，然后在 4℃下繼續(xù)孵育 2 小時.

• 去除雜質(zhì)：反應終止后，可采用透析法或凝膠過濾色譜法等對標記產(chǎn)物進行純化，以去除未反應的 FITC、乳糖以及其他雜質(zhì)。透析時可選擇合適截留分子量的透析袋，在適當?shù)木彌_液中進行透析；凝膠過濾色譜則可根據(jù)分子大小的差異將標記產(chǎn)物與雜質(zhì)分離開來.

產(chǎn)物鑒定與檢測

• 熒光檢測：使用熒光光譜儀對純化后的 FITC - 乳糖產(chǎn)物進行熒光檢測，激發(fā)波長一般為 490 - 495nm，發(fā)射波長為 515 - 525nm，觀察其熒光強度和光譜特征是否符合預期，以確定標記是否成功以及標記效率的高低.

• 其他檢測：還可結(jié)合其他分析方法，如高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等對標記產(chǎn)物的純度、結(jié)構(gòu)等進行進一步的鑒定和分析，以確保獲得高質(zhì)量的 FITC - 乳糖標記產(chǎn)物.

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