1.細(xì)胞毒性測(cè)試

MTT 法（四唑鹽比色法）

將細(xì)胞接種于 96 孔板中，培養(yǎng)至合適密度（例如，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞）。設(shè)置不同 CY2 - 牛血清白蛋白（CY2 - BSA）濃度梯度的實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只含細(xì)胞和培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照組（含未標(biāo)記的 BSA 和細(xì)胞、培養(yǎng)基）。

將 CY2 - BSA 加入實(shí)驗(yàn)組孔中，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間（如 24 - 48 小時(shí)）。然后向每孔加入 MTT 溶液，繼續(xù)孵育 3 - 4 小時(shí)，使 MTT 被活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶。棄去上清液，每孔加入 DMSO 溶解甲臜結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。

根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率 =(實(shí)驗(yàn)組吸光度 - 空白組吸光度)/(陰性對(duì)照組吸光度 - 空白組吸光度)×100%）。選擇細(xì)胞存活率在一定范圍內(nèi)（如 80% 以上）的 CY2 - BSA 濃度，初步確定為安全濃度范圍。

Live/Dead 細(xì)胞染色法

同樣將細(xì)胞接種并設(shè)置 CY2 - BSA 濃度梯度實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。將 CY2 - BSA 加入實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)后，用 Live/Dead 細(xì)胞染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

活細(xì)胞被染成綠色，死細(xì)胞被染成紅色。通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞和死細(xì)胞的比例。確定使細(xì)胞死亡率較低的 CY2 - BSA 濃度范圍。

2.熒光強(qiáng)度測(cè)試

體外實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)備一系列不同濃度的 CY2 - BSA 溶液，在固定激發(fā)波長(zhǎng)（CY2 的激發(fā)波長(zhǎng)一般在 488 - 495nm 左右）下，使用熒光光譜儀測(cè)量其熒光發(fā)射強(qiáng)度（CY2 的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在 500 - 520nm 左右）。

繪制熒光強(qiáng)度 - 濃度曲線，隨著 CY2 - BSA 濃度增加，熒光強(qiáng)度通常會(huì)增加，但當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)熒光自猝滅現(xiàn)象，即熒光強(qiáng)度不再隨濃度增加而線性增加，甚至下降。選擇熒光強(qiáng)度增加且未出現(xiàn)明顯自猝滅的濃度范圍，這個(gè)范圍通常是比較合適的標(biāo)記濃度范圍。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（以小動(dòng)物成像為例）

將不同濃度的 CY2 - BSA 通過(guò)合適的途徑（如靜脈注射、腹腔注射等）注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)，使用體內(nèi)成像系統(tǒng)在 CY2 的熒光發(fā)射波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行成像。

觀察不同濃度下熒光信號(hào)在體內(nèi)的分布和強(qiáng)度變化。選擇既能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的可檢測(cè)熒光信號(hào)，又不會(huì)因濃度過(guò)高導(dǎo)致非特異性結(jié)合和背景信號(hào)過(guò)強(qiáng)的 CY2 - BSA 濃度。

3.標(biāo)記效率測(cè)試

光譜法結(jié)合蛋白定量法

采用不同濃度的 CY2 - BSA 進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，反應(yīng)完成后，通過(guò)紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量 CY2 的吸收峰（在 488 - 495nm 左右）強(qiáng)度來(lái)估算 CY2 的含量，同時(shí)使用蛋白定量方法（如考馬斯亮藍(lán)法、BCA 法等）確定 BSA 的含量。

根據(jù) CY2 和 BSA 的含量計(jì)算標(biāo)記效率（標(biāo)記效率 =（實(shí)際標(biāo)記的 CY2 摩爾數(shù) / 理論上可標(biāo)記的 CY2 摩爾數(shù)）×100%）。選擇標(biāo)記效率較高的 CY2 - BSA 濃度作為最佳標(biāo)記濃度。

4.電泳結(jié)合熒光成像法

對(duì)不同濃度 CY2 - BSA 標(biāo)記后的產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）。由于 CY2 帶有熒光，通過(guò)熒光成像系統(tǒng)觀察電泳后的凝膠，比較不同濃度標(biāo)記產(chǎn)物的條帶熒光強(qiáng)度和位置。

標(biāo)記效率高的 CY2 - BSA 濃度對(duì)應(yīng)的條帶熒光強(qiáng)度相對(duì)較高且條帶位置符合預(yù)期（CY2 標(biāo)記后 BSA 分子量增加），綜合判斷選擇最佳標(biāo)記濃度。

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